實驗的每一小步，都是決定結(jié)果的一大步。本期將為大家講解抗原修復的重要性，喜歡的話就繼續(xù)往下看吧！

盡管固定對于組織形態(tài)的保留是bi不可少的，但這一過程對IHC/ICC檢測也有不良影響。固定可能改變蛋白的生化特性，如目的表位被掩蓋不再與一抗結(jié)合。表位的掩蓋可能是由表位內(nèi)氨基酸的交聯(lián)、表位或附近位點與無關肽段的交聯(lián)、表位構(gòu)象的改變或抗原靜電荷的改變引起的?？乖迯椭傅氖侨魏慰梢阅孓D(zhuǎn)表位掩蓋和恢復表位-抗體結(jié)合的技術。

抗原修復技術

抗原修復的需要取決于多個變量，包括但不限于，目的抗原、所使用的抗體、組織類型，以及固定方法和持續(xù)時間。多克隆抗體能識別多個表位，因此即使不進行抗原修復，它們也比單克隆抗體更有可能檢測到特定抗原。

目前有多種技術可恢復表位的免疫反應性。簡單的方法有改變抗體稀釋液的ρH或陽離子濃度，這可能影響抗體與表位的親和力。對于部分掩蓋的表位，在開始抗原修復之前可以先試試改變一抗的孵育條件。不過，這一步也需要抗體濃度、孵育時間和溫度的進一步優(yōu)化。在討論抗體修復方法時，技術通常分為兩大類，蛋白酶誘導的表位修復（PIER）和熱誘導的表位修復（HIER）。一旦優(yōu)化好，抗原修復的影響可以是明顯的。

蛋白酶誘導的表位修復（PIER）

在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢復抗體與表位的結(jié)合。人們認為作用機制是切割了可能遮蓋表位的肽段。PIER的缺點在于恢復免疫反應性的成功率低，且有可能破壞組織形態(tài)和目的抗原。

熱誘導的表位修復（HIER）

HIER被認為能逆轉(zhuǎn)一些交聯(lián)，并實現(xiàn)表位二級或三級結(jié)構(gòu)的重建。實驗方案必須針對每種組織、固定方法和待研究抗原進行優(yōu)化?？偟膩碚f，HIER的成功率比PIER要高得多。

HIER可利用微波爐、高壓鍋、蒸屜、高壓滅菌鍋或水浴開展。在HIER實驗中，微波爐是越來越流行的設備。這些方案大多加熱5分鐘，然后更換緩沖液。對于所有HIER方法，在開始IHC/ICC孵育之前必須讓玻片冷卻。HIER對時間、溫度、緩沖液和pH特別敏感，最佳方法必須根據(jù)經(jīng)驗確定。

優(yōu)化和局限性

抗原修復可能需要加強樣品與玻片或蓋玻片的附著。此外，此技術對于冰凍組織切片和醇固定切片通常過于劇烈。對于每種設備，時間、溫度和pH必須經(jīng)過優(yōu)化（如92-95°C水浴要5-10分鐘，而120°C高壓鍋要1-5分鐘）。為了優(yōu)化抗原修復，必須開展預實驗，使用時間、溫度和pH的各種組合。在使用抗原修復方法時，應始終考慮到假陽性的可能性。實驗應當包含對照，以證明特異的抗體結(jié)合，因為染色常受到實驗中多個變量的影響。