細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：指的是細(xì)胞在體外條件下的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)的過(guò)程中細(xì)胞不再形成組織（動(dòng)物）。
 
定義
培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)都要生活在人工環(huán)境中，由于環(huán)境的改變，細(xì)胞的移動(dòng)或受一些其他因素的影響，培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)，傳代導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)單一化型。
 
在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)研究中應(yīng)用廣泛
優(yōu)點(diǎn)
1.直接觀察活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)。用于細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué) 等多種學(xué)科研究.
 
2.直接觀察細(xì)胞的變化可便于攝影。
 
3.研究細(xì)胞種類如低等到高等到人類、胚胎到成體、正常組織到腫瘤。
 
4.便于使用各種技術(shù)：相差、熒光、電鏡、組化、同位素標(biāo)記等方法觀察和研究細(xì)胞狀況。
 
5.是分子生物學(xué)和基因工程學(xué)的研究對(duì)象，也是其主要的組成部分。
 
6.易于施用物理、化學(xué)生物的實(shí)驗(yàn)研究。
 
7.易于提供大量生物性狀相似的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,耗資少比較經(jīng)濟(jì)。
 
8.成為生物制品單克隆抗體生產(chǎn)和基因工程等的材料來(lái)源。
缺點(diǎn)
組織和細(xì)胞離體后獨(dú)立生存在人工的培養(yǎng)環(huán)境中，雖然模擬體內(nèi)環(huán)境，仍有很大差異。 因而利用培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時(shí)，不應(yīng)視為體內(nèi)細(xì)胞相同，把實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)體內(nèi)，輕易做出與體內(nèi)等同的結(jié)論。
細(xì)胞類型
細(xì)胞類型根據(jù)是否附于支持物上生長(zhǎng)的特性，分為: 貼附型 懸浮型
 
（一）貼附型
 
細(xì)胞貼附在支持物表面生長(zhǎng)，只依賴貼附才能生長(zhǎng)的細(xì)胞叫做貼附型細(xì)胞(Anchorrage-dependent cells)這種現(xiàn)象與細(xì)胞分化有關(guān)。
 
貼附型細(xì)胞的分型
 
1.成纖維型細(xì)胞：(fibroblast) 來(lái)自中胚層
 
特點(diǎn)：與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相似,胞體梭型或不規(guī)則三角形,中央有圓形核,胞質(zhì)向外伸出2～3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀,漩渦或火焰狀走行。
 
起源：細(xì)胞來(lái)自中胚層間充質(zhì)組織。
 
除真正的成纖維細(xì)胞、心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞。
 
注意：細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)成為成纖維型細(xì)胞是一種慣稱,與體內(nèi)細(xì)胞不同。
 
2.上皮型細(xì)胞(epithlium cell type) 來(lái)自外胚層 特點(diǎn)：扁平不規(guī)則多角型、圓形核、細(xì)胞緊密相連成細(xì)胞增殖數(shù)目增多時(shí),整個(gè)上皮膜隨之移動(dòng)。邊緣細(xì)胞很少脫離細(xì)胞群而單獨(dú)活動(dòng)“ 拉網(wǎng)"現(xiàn)象與起源內(nèi)外胚層組織有關(guān)。
 
組織: 皮膚表皮及其衍生物(汗腺、皮脂腺)消化道分上皮、肝、胰、肺泡上皮。
 
3. 游走型細(xì)胞(wandering cell type)
 
特點(diǎn)：在支持物上散在生長(zhǎng),不連接成片,胞質(zhì)伸出偽足或突起呈活躍的游走或變形運(yùn)動(dòng),速度快不規(guī)則, 密度大連接成片呈多角形不易與其他類型的細(xì)胞 區(qū)別。
 
4. 多形型細(xì)胞 (polymorphic cell type)
 
特點(diǎn)： 無(wú)規(guī)律的形態(tài)，如神經(jīng)細(xì)胞。
 
懸浮型細(xì)胞(suspended cell type)
 
特點(diǎn)： 不貼附在支持物生長(zhǎng)，胞體圓形，在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)空間大，可長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)，繁殖旺盛便于做細(xì)胞代謝研究。S180肉瘤、血液里的白細(xì)胞、K562、 HL－60。
 
分型的目的：
 
方便描述細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的形態(tài)變化。培養(yǎng)條件好時(shí)，細(xì)胞相對(duì)穩(wěn)定，可反映出起源、正常異常的區(qū)別，作為判定細(xì)胞生物學(xué)性狀指標(biāo)。
 
強(qiáng)調(diào)：一般形態(tài)并不是一項(xiàng)可靠指標(biāo)要受各方面影響。
 
如：反復(fù)開(kāi)關(guān)溫箱、溫度、C02的濃度、培養(yǎng)基變堿、支原體、pH值。細(xì)胞在接種時(shí)呈三角型狀態(tài)，經(jīng)培養(yǎng)一定時(shí)間后，細(xì)胞在傳代前已形成上皮型細(xì)胞。

細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖
培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、器皿或其他容器，生存空間及營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖到一定密度后，分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，使細(xì)胞更好地生存，這一過(guò)程稱之為“ 傳代"(passage或subculture)。 值得注意的是：每次傳代細(xì)胞在生長(zhǎng)和增殖方面受到一定的影響
細(xì)胞生命期(life span of culture cells)
指細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。一般根據(jù)細(xì)胞種類、性狀和原供體的年齡的情況而定。
 
如：二倍體成纖維細(xì)胞，在不凍存和反復(fù)傳代條件下可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維持一年左右的生命，細(xì)胞便開(kāi)始凋亡(apoptosis)。 細(xì)胞在生存過(guò)程中經(jīng)歷以下三個(gè)階段
 
1.原代培養(yǎng)期(primary culture)
 
組織到第一次傳代 時(shí)間大約為1～4周
 
特點(diǎn)：
 
細(xì)胞活躍移動(dòng),分裂,但不旺盛多呈二倍體核型。
 
原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)基本相似。
 
各細(xì)胞的遺傳性狀互不相關(guān)，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)，如果把這種稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細(xì)胞獨(dú)立生存性差。
 
2.傳代期(passage)
 
初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便稱之為細(xì)胞系(cell line)
 
特點(diǎn)：
 
細(xì)胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細(xì)胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代或傳代早期凍存為好。
 
一般細(xì)胞在10代以內(nèi)凍存。
 
凍存配方：
 
向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。
 
存于在液氮中溫度可達(dá)到－196℃，可長(zhǎng)期儲(chǔ)存。如解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，細(xì)胞性狀不受影響，成為保存細(xì)胞最主要的手段。
 
3.衰退期
 
特點(diǎn)：細(xì)胞仍生存 增殖減慢 不增殖 輪廓增強(qiáng) 衰退凋亡
 
注意：細(xì)胞在三期中的任何一期（一般發(fā)生在傳代后期或衰退期）在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneous transformation);
 
細(xì)胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性性(malignancy)。細(xì)胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱為連續(xù)細(xì)胞系(continuous cell line)。而細(xì)胞獲得不死性后,細(xì)胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。
培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期
“ 一代"指細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的所用的時(shí)間。與細(xì)胞倍增一代不是一個(gè)含義。在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次，經(jīng)歷三個(gè)階段：
 
1. 潛伏期(latent phase) ：
 
接種 經(jīng)過(guò) 懸浮期(細(xì)胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形) 貼壁。
 
初代培養(yǎng)細(xì)胞 經(jīng)過(guò) 10～24小時(shí)或更多時(shí)間。
 
連續(xù)細(xì)胞系和癌細(xì)胞系 經(jīng)過(guò) 10～30分鐘 貼附。
 
貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和受多種因素的影響。
 
影響細(xì)胞貼附：底物表面不干凈，影響細(xì)胞貼附。
 
利于細(xì)胞貼附：底物表面帶有陽(yáng)性物質(zhì)與特殊物質(zhì):
 
纖粘連蛋白(fibronectin FN)、
 
細(xì)胞表面蛋白(cell surface proteinCSP)
 
這些物質(zhì)有的存在與細(xì)胞表面,有的來(lái)自血清。
 
潛伏期特點(diǎn)：
 
長(zhǎng)短與細(xì)胞接種密度、種類、使用的培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。
 
(1)細(xì)胞貼附后進(jìn)入潛伏期,細(xì)胞無(wú)增殖。少見(jiàn)分裂相，細(xì)胞有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)。
 
(2)初代培養(yǎng) 細(xì)胞潛伏期約為24～96小時(shí)或更長(zhǎng)，
 
連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期約6～24小時(shí)。
 
(3)細(xì)胞接種密度大潛伏期短。
 
(4)細(xì)胞出現(xiàn)分裂相增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)增生期。
 
2．指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)：
 
特點(diǎn)：細(xì)胞增殖最旺盛階段,分裂相增多。
 
細(xì)胞分裂指數(shù)(mitotie index MI) ：
 
表示每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。
 
條件：分裂相數(shù)與細(xì)胞種類、培養(yǎng)成分、pH培養(yǎng)箱溫度有關(guān)。
 
細(xì)胞分裂指數(shù)：
 
初代細(xì)胞：在0.1％～0.5％之間％ ,
 
連續(xù)分裂細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞：3 ～5％。
 
指數(shù)增生期是作為細(xì)胞一代活力較好時(shí)期,是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好和最主要的階段。
 
指數(shù)增生期持續(xù)3～5天，細(xì)胞數(shù)量增多后生長(zhǎng)空間變小，細(xì)胞相互接觸可連接成片。
 
正常細(xì)胞：細(xì)胞相互接觸能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為接觸抑制(contact inhibition)。
 
腫瘤細(xì)胞：沒(méi)有這種現(xiàn)象，可作為區(qū)別正常與腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志之一。當(dāng)腫瘤細(xì)胞達(dá)到一定密度后向三維空間發(fā)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積(piled up)。
 
由于細(xì)胞不斷增殖分裂，細(xì)胞數(shù)量持續(xù)增多，培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞受營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制(Density inhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。
 
3.停滯期(stagnate phase)
 
細(xì)胞量和密度達(dá)到飽和，細(xì)胞停滯增殖。表明細(xì)胞進(jìn)入到停滯期,細(xì)胞數(shù)量持平，也稱為平頂期(plateau）。
 
特點(diǎn)：細(xì)胞不增殖,有代謝活動(dòng)。培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)已逐漸耗盡,代謝產(chǎn)物積累增多,pH降低，此時(shí)需要傳代,否則細(xì)胞將會(huì)中毒,發(fā)生形態(tài)改變,細(xì)胞會(huì)從底物脫落死亡。
 
注意：
 
傳代過(guò)晚將影響下一代細(xì)胞的生長(zhǎng),至少要再傳 1～2代 ,通過(guò)換液淘汰死細(xì)胞和受損較輕的細(xì)胞。待細(xì)胞全部恢復(fù)后再用。
 
在這一點(diǎn)上要特別注意。